基于滤膜上细菌直接计数法的细菌总数快速检测
【摘要】 细菌总数快速检测在质量监测中具有重要的意义，目前除了经典的平板培养法以外，还有微菌落法、阻抗法等快速检测方法，这些方法或者需要较长的检测时间，或者需要较高的检测成本。本研究提出一种不需要培养而在滤膜上直接计数的细菌总数的快速检测方法，它主要分为过滤、染色、显微镜计数和计算四个步骤。计算细菌总数时，根据细菌在滤膜上的分布特点，对传统公式进行改进，提出按区域计算细菌总数的计算方法，提高了检测精度。研究结果表明，该方法与传统的平板培养法无显著性差异（t=0.847，P=0.436＞0.05），是一种低成本、快速的细菌总数检测方法。
1 引 言
细菌总数计数的研究已有很多，目前国标规定的方法为平板计数法，该方法是将样品加入琼脂营养基，在37 ℃下培养24～48 h后计数。这种方法精度高，但耗时长，难以满足实际工作需要。为了简化检测程序、缩短检测时间，国内外学者进行了大量的快速检测方法的研究，提出了阻抗检测法〔1〕、Simplate TM全平器计数法〔2〕、微菌落技术〔3-5〕、纸片法〔6-7〕等检测方法，取得了的成果，但检测时间仍在4 h以上。
本研究在分析了已有研究成果的基础上，提出了在滤膜上染色后，直接计数的细菌总数检测方法，具体步骤为：用集菌仪进行细菌收集→在膜上进行染色→在油镜下计数→按公式计算出菌液浓度。实验结果表明，该方法与传统的平板培养法无显著性差异，检测时间约1 h，是一种快速的细菌总数检测方法。
2 材料与方法
2.1 材料
本研究中用的试验材料有集菌仪（杭州泰林生物技术设备有限公司），染色剂，生物显微镜（宁波永新光学股份有限公司），聚碳酸脂膜（直径47 mm）。
2.2 实验方法
2.2.1 准备工作 卸下集菌仪的滤网（见图1），统计滤网上小孔总数，为计算菌液浓度做准备。另外，还需对集菌仪中的集菌器进行高压灭菌，以防止过滤过程中引入外源细菌。
2.2.2 细菌收集 取浓度的霉菌菌液300～500 ml，装在集菌仪上，集菌仪采用蠕动加压方式对菌液施加的压力，使菌液流过孔径为0.45 um的聚碳酸脂膜。采用过滤方法是因为它可以使细菌相对均匀地分布在滤膜上，而选用聚碳酸脂膜是因为这种膜具有良好的透光性，便于用显微镜观察。
2.2.3 染色 集菌后取下滤膜，切下一部分放在载玻片上，进行染色、固定。染色的目的是增大细菌与背景的对比度，便于观察。
2.2.4 显微镜计数与计算 菌液经集菌仪过滤后，细菌在滤膜上的分布见图2、图3，由图可以看出细菌分布具有以下两个特点：一是细菌集中在一个个的圆形区域内，这些圆形区域和挡板的小孔相对应；二是各个圆形区域之间细菌很少。根据膜上细菌分布的这种特点，提出以圆形区域为单位进行计数，统计出圆形区域内细菌的平均个数，从而计算出菌液中细菌总数。具体步骤如下：随机选择10个圆形区域，在油镜下，调节焦距以获得较清晰的图像（见图4），统计每个圆形区域内的细菌个数，然后按公式(1)计算出菌液的浓度。
X=A10×N/V(1)图2 膜上细菌的区域分布
Fig 2 The distributing region of bacteria on the filter(100倍)
图3 膜上细菌的区域间隔
Fig 3 The space among the distributing regions(100倍)
图4 膜上细菌染色后图像
Fig 4 Figure of bacteria after coloration(1 000倍)
式中：X表示待检菌液浓度（CFU/ml）
A表示10个圆形区域内细菌总数
N表示滤网上小孔总数
V表示集菌时所用待检菌液体积（ml）
3 结果与讨论
3.1 实验结果
按上述方法计算得到的结果与平板培养法得到的结果见表1。表1 两种方法得到的细菌总数
Table 1 Total bacteria number by two different methods
样本1样本2样本3样本4样本5样本6染色镜检
(cfu/ml）185168157165171166平板培养
(cfu/ml)176155165158183152
对表1中两组数据进行配对t检验，在α=0.05时，双尾检验结果如下：t=0.847，P=0.436＞0.05，说明两种方法得到的结果无显著性差异。
3.2 讨论
3.2.1 计算公式的改进 用集菌仪对样本菌液进行过滤时，由于滤网挡板的作用，使得细菌不是均匀地分布在整个滤膜上，而是集中分布在滤网的小孔处，所以，计算细菌总数时，不能采用公式X=A40×Φ1Φ22/V（其中Φ1，Φ2分别为滤膜直径和视野直径），该公式是微菌落方法检测细菌总数中的常用计算公式。在本实验中，根据细菌分布的特点，提出以圆形区域为单位计算细菌总数的思路，使计算结果更接近真实值，从而提高了检测精度。
3.2.2 细菌大小的影响 细菌大小对本实验的影响主要体现在镜检时，如果细菌太小，显微镜计数时不能将细菌从背景中分辨出来，我们的实验结果显示，不能分辨大肠杆菌和葡萄球菌，而较大的霉菌可以清晰地分辨。
3.2.3 检测时间进一步缩短 细菌总数的经典检测方法是平板培养法，得到的结果精度高，但是它所用时间长，为了缩短检测时间，出现了微菌落法，将检测时间缩短为4 h左右〔3-5〕。本研究不对细菌进行培养，而是在膜上染色后直接用显微镜计数，大限度地缩短了检测时间，使整个检测时间在1 h左右。
4 结论
本研究用集菌仪将菌液过滤后，取滤膜一部分进行染色、制片，然后在油镜下统计细菌个数。根据细菌在滤膜上的分布特点，提出将圆形区域作为统计单位，得到圆形区域内细菌的平均个数，从而计算出菌液浓度。实验结果表明，按照该方法得到的结果与平板培养法的结果无显著性差异。与平板培养法和微菌落法相比，该方法不需要细菌培养，检测时间只需要1 h左右，明显缩短了检测时间，是一种快速、有效的细菌总数检测方法。