如何用二氧化碳培养箱进行细胞复苏

（1） 准备

   无菌超净台，酒精灯，75%酒精喷壶，二氧化碳培养箱，37℃水浴锅，离心机；培养瓶，含10%胎牛血清的*培养基和基础培养基以及PBS磷酸缓冲液（提前放置超净台使平衡到室温），无菌工作服（白大褂），*罩，手套，记号笔

（2） 步骤

   1.穿好无菌工作服，带上*罩和手套，快速从液氮里取出冻存管，快速放进37℃水浴锅缓慢摇晃使细胞解冻，注意冻存管的封口膜不要破裂，防止污染。

   2.解冻后用纸擦干冻存管表面的水滴，酒精喷壶喷洒适量75%酒精消毒冻存管封口处。

   3.开超净台，点燃酒精灯燃烧片刻后（可提前准备），冻存管放超净台，换新手套，小心打开冻存管，避免污染，无菌吸管将1ml细胞全部吸出至5ml无菌EP管，补加9ml基础培养基稀释，1000rpm，离心5min使细胞沉淀，弃上清。

   4.加入新鲜配制的含10%血清的培养基4ml，轻轻混匀，用吸管将细胞移至25T培养瓶。

   5.平躺放置培养瓶，8字形混匀后，置于37℃，5%二氧化碳培养箱培养。

   6.培养24小时后，显微镜观察细胞（贴壁细胞）贴壁后，小心更换培养基，根据不同细胞的生长状态进行传代培养，培养瓶上标记：操作者，时间，细胞类型。

   7.有的实验员的培养基会加入抗生素防止细胞污染，但是这对于掌握细胞培养是非常不利的，不加抗生素培养细胞更能提醒实验者无菌操作的意识。一旦细胞出现污染，易于发现，一旦发现污染的细胞应立刻煮沸丢弃，以免污染同实验室其他细胞。

   8.细胞长满90%-100%即可传代，小心打开培养瓶，瓶口过酒精灯消毒，弃培养基。

   9.加入1mlPBS，润洗细胞，重复3次，弃PBS。

   10.加入4ml*培养基，用无菌吸管小心吹打贴壁细胞或者用胰蛋白酶消化细胞使细胞脱落。

   11.转移1/2脱落的细胞至新的培养瓶，各瓶补加*培养基至4ml。

   12.小心封口，平躺放置培养瓶，8字形混匀后，置于37℃，5%二氧化碳培养箱培养。

   13.待长满后，按同样的方法传代培养。二  冻存

当不需要使用细胞或者细胞量足够时，可以将细胞冻存起来，供以后实验用

（1） 准备自

    细胞冻存液（20%血清、10%DMSO、70%基础培养液），梯度降温盒

（2） 步骤

        1.选取活力好，密度约70%细胞用于冻存，此时细胞处于对数生长期，用于冻存。

        2 .细胞吹打或者胰酶消化后，转移至无菌EP管，1000rpm里面5min。

        3.弃上清，加入新鲜配制的细胞冻存液，25T细胞可以加入2ml细胞冻存液，分装2个冻存管，细胞*密度为5*106-1*107个每ml。

        4.做好标记，放入梯度降温盒（提前平衡至室温）。

        5.将梯度降温盒放入-80℃冰箱过夜，DI二天取出冻存管，快速放入液氮保存。

氧化碳培养箱是进行细胞培养的必要设备，那么在培养细胞时有哪些经验是我们可以借鉴的呢？下面让我们一起来看一下。

1、启蒙老师的重要性

一般进实验室都有师兄师姐带着做，他们就是你做细胞的启蒙老师。他们的操作手法、细节、理论讲解就成了你操作的准则，如营养液、细胞瓶的摆放位置；灭菌处理程序；开盖手法；细胞吹打手法等等。要学会他们的正确操作，在DI一次的时候就要重视。

2、像养孩子一样养细胞

细胞真的很脆弱，*好每天都去看看它，以防止出现培养箱缺水、缺二氧化碳、停电、温度不够等异常现象，也好及时解决这些意外，避免重复实验带来的更大痛苦。

3、好细胞要及时保种

细胞要分批传代，这样即使有一批出了问题，还有一批备用的。像后者一般人可能不容易做到。有一次细胞污染了，全军覆没。当时可后悔没有保种。

4、每种细胞都有自己的特性，要区别对待。

细胞跟人一样，不同的细胞，培养特性是不一样的。培养过程中要细细体会。不同细胞株使用不同的培养基和血清。

如平滑肌细胞很活跃，喜欢热闹，2~3 天就好多人口，而且不太爱吃喝，真是*好养的孩子了。内皮细胞和平滑肌细胞性格相近，不过它很不讲卫生，也很邋遢，里面有很多分泌屋，要经常换洗才行。RAW264.7 细胞也很开朗，而且很能吃，要经常喂它，头疼的是细胞很容易活化，培养它的瓶子和环境没有内毒素才好。

5、培养前的工作准备充分

包括耗材的处理、试剂的配置，无菌检验等等。
玻璃器皿的清洗。对于玻璃器皿（细胞瓶、装营养液的瓶子、小青霉素瓶等）要先用洗衣粉刷干净（注意死角），然后冲干净。用酸液浸泡 24 h 以上，之后用清水冲洗 10 遍，除去残留酸液。瓶子之类，冲洗过程要使劲摇晃。然后在双蒸水浸泡 24 h。晾干后包扎，160℃ 干烤 2 h 待用。
试剂配置。细胞培养用的液体一般使用双蒸以上的水即可。并注意 pH 值的调节。
无菌检验。主要采用过滤除菌：如胰酶、抗生素、G-418 溶液、各类培养基、丙酮酸钠、谷氨酰胺等。有些可以采用高压灭菌：如 PBS、D-Hank's等。

6、试剂分装保存

包括营养液、胰酶、血清等。

血清特别重要。血清必须贮存于 –20℃，如果一次无法用完一瓶，可将 40～50ml 分装于无菌酸处理瓶中，甚至置青霉素瓶保存。一般厂商提供的血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。（一般情况下不影响细胞培养）

瓶装血清一定要逐步解冻: 4℃ 冰箱全溶后再分装，在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由 –20℃ 直接至 37℃ 解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。

热灭活是指 56℃，30 分钟加热已*解冻之血清。水浴锅升到 56℃后，将血清放入，待温度升高到 56℃ 后计时，一般 5 分钟左右规则摇晃均匀一次。此热处理之目的是使血清中之补体成份去活化。除非必须，一般不要作此热处理，因为会造成沉淀物之显著增多，且会影响血清之品质。注意更换新血清（包括不同批次）对细胞的影响。

7、无菌意识要强

实验进行前，超净台以紫外灯照射 30 分钟灭菌，以 70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启超净工作台风扇运转数分钟后，才开始实验操作。

每次操作只处理一株细胞株，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以 70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。

无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如支架、吸管等公用物品可以暂时放置，其它个人实验用品用完应立即拿出。实验用品以 70% 乙醇擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在中央无菌区域，一般勿在边缘区域操作。

小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约 45° 角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。

8、选择正确的培养基 

不同的细胞可能培养基不同，甚至不同的文献可能对相同的细胞培养基成分也是可能不同的。如我当时培养神经干细胞，有文献就选用 neurobase 培养基，而我的实验目的主要是做抗氧化和氧化方面的，而这种培养基中含有抗氧化剂成分，此时，我就不得不选择另外一种不含抗氧化剂的培养基。